TUNEL细胞凋亡检测技术服务

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  • 发布时间:2019-08-11
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简介 TUNEL细胞凋亡检测技术服务原理:TUNEL(TdT-mediateddUTPnickendlabeling)细胞凋亡检测是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况,其原理是生

TUNEL细胞凋亡检测技术服务

TUNEL细胞凋亡检测技术服务原理:TUNEL(TdT-mediateddUTPnickendlabeling)细胞凋亡检测是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况,其原理是生物素biotinylate标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdTEnzyme)的作用下,可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端,并与连接辣根过氧化酶(HRP,horse-radishperoxidase)的链霉亲和素streptavidin特异性结合,后者又与POD底物H2O2、二氨基联苯胺(DAB)产生深棕色反应,特异准确地定位正在凋亡的细胞,因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞;由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂,因而没有3’-OH形成,很少能够被染色。

本试剂盒适用于组织样本(石蜡包埋、冰冻和超薄切片)和细胞样本(细胞涂片)在单细胞水平上的凋亡原位检测。 还可应用于抗肿瘤药的药效评价,以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段实验步骤:Roche公司试剂盒1、用二甲苯浸洗2次,每次5min;2、用梯度乙醇(100、95、90、80、70%)各浸洗1次,每次3min;3、PBS漂洗2次;4、用ProteinaseK工作液处理组织15~30min在21~37℃或者加细胞通透液8min;5、PBS漂洗2次;6、制备TUNEL反应混合液,处理组用50μlTdT+450μl荧光素标记的dUTP液混匀;而阴性对照组仅加50μl荧光素标记的dUTP液,阳性对照组先加入100μlDNase1,反应在室温~37℃×10~30min,后面步骤同处理组;7、玻片干后,加50μlTUNEL反应混合液(阴性对照组仅加50μl荧光素标记的dUTP液)于标本上,加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×60min;8、PBS漂洗3次;9、可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞(激发光波长为450~500nm,检测波长为515~565nm);10、玻片干后加50μlconverter-POD于标本上,加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min;11、PBS漂洗3次;12、在组织处加50~100μlDAB底物,反应15~25℃×10min;13、PBS漂洗3次;14、拍照后再用苏木素或甲基绿复染,几秒后立即用自来水冲洗。 梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片;15、加一滴PBS或甘油在视野下,用光学显微镜进行计数(200~500个细胞)并拍照Promega公司试剂盒1、脱蜡:用二甲苯浸洗5min×2次;2、水化:用梯度乙醇(100%×5min、100%×3min、95%×3min、85%×3min、70%×3min、50%×3min);3、浸洗:%NaCl×5min→PBS洗5min;4、固定:浸入4%多聚甲醛15min;5、浸洗:PBS5min×2次;6、细胞通透:用每片100μl20μg/mlProteinaseK处理组织15(10~30)minRT;7、浸洗:PBS洗5min;8、固定:浸入4%多聚甲醛5min;9、浸洗:PBS5min×2次;10、平衡:加100μl平衡液,湿盒平衡10(5~10)min;11、制备TUNEL反应混合液:处理组用1μlrTdT+1μl生物素标记的dUTP+98μl平衡液混匀;而阴性对照组不加rTdT,改为三蒸水;阳性对照组先加入100μlDNase1缓冲液孵育5min,甩掉液体后再加100μlDNase1(10U/ml)酶切10min,用去离子水冲洗4次,PBS浸洗5min,后面步骤从第10步开始;12、标记反应:加100μlTUNEL反应混合液于标本上,加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1h;13、终止反应:浸入2×SSC15min;14、浸洗:PBS5min×3次;15、封闭POD:浸入%H2O215min;16、浸洗:PBS5min×3次;17、酶标反应:加100μlstreptavidin标记HRP(按1:500PBS稀释)30min;18、浸洗:PBS5min×3次;19、DAB显色(避光):加100μlDAB混合液(50μlDAB+50μlDAB底物缓冲液+50μlH2O220×+950μl三蒸水)10min左右,镜下出现浅棕色背景时;20、用去离子水冲洗几次;21、用苏木素复染,3s左右后立即用自来水冲洗。

梯度酒精脱水(50、70、85、95、100、100%各1min)、二甲苯透明1min×2次、中性树胶封片。

标本收集及注意事项:1、标本从取材到固定应在2h以内完成。

2、未打开的试剂盒贮存在-20℃,一旦解冻,就保存在4℃下,避免反复冻融。 3、初次检测细胞凋亡,最好设置阳性和阴性对照片。

4、假阳性高是TUNEL检测的一个主要缺点。

观察TUNEL阳性片是应对照HE切片。

结合细胞HE染色来判断阳性的细胞究竟是假阳性还是真正发生了凋亡。

实验结果及数据:收到标本后15-20个工作日之内将作好的片子交于客户。

基本收费:60元/张做2-3张预实验片注:客户提供蜡块或者切片及原位杂交试剂盒,公司也代购试剂盒。